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NAD-蘋果酸酶試劑盒說明書-相關(guān)技術(shù)文章

更新時(shí)間:2025-02-17      瀏覽次數(shù):711


 

NAD-蘋果酸酶(Malic enzyme,NAD-ME試劑盒說明書

微量法 100 /96 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),產(chǎn)生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME 活性測定較多,已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理:

NAD-ME 催化NAD+還原成NADH,在 340nm 下測定NADH 增加速率。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BF6008-100T/96S

Storage

提取液:

100ml

4℃

試劑一:液體

20ml

4℃

試劑二:液體

10ml

4℃

試劑三:粉劑

1

-20℃

說明書

一份

 

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前理:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、檢測工作液的配制:用時(shí)在試劑三中加入 15ml 試劑一和 1ml 蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、測定前將檢測工作液在 37℃(哺乳動(dòng)物) 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、55μl 試劑二和 160μl 工作液,混勻后立即記錄 340nm

處初始吸光值A1 1min 后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。 注意:如果ΔA0.005,可將反應(yīng)時(shí)間延長到 2 分鐘或 5 分鐘。 NAD-ME 活性計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T =7.234×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 LεNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑, 1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 ml;V 樣總:加入提取液體積,1 ml;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

b.  96 孔板測定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V ) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ÷V 樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ÷V 樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;εNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol;d96 孔板光徑,0.5cm; V 樣:加入樣本體積,0.01 mlV 樣總:加入提取液體積,1 ml;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。


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