AAT Bioquest1600  mFluor™ Violet 450 maleimide 1mg 

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美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學研究、診斷研發(fā)及藥物開發(fā)的科學家研發(fā)、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術。AAT Bioquest的產品幫助quan世界的科學家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。AAT Bioquest會不斷介紹新產品，快速的豐富各個領域的產品。

AAT Bioquest1600 mFluor™ Violet 450 maleimide 1mg，產品簡介：

產品品牌：AAT Bioquest

產品貨號：1600

產品名稱：mFluor™ Violet 450 maleimide

產品規(guī)格：1mg

 AAT Bioquest  mFluor™ Violet 450 maleimide 

產品說明：

mFluor™染料專為多色流式細胞術應用而開發(fā)。這些染料具有較大的斯托克斯位移，并且可以被流式細胞儀的激光線（例如，405 nm、488 nm和633 nm）很好地激發(fā)。mFluor™ Violet 450染料的熒光激發(fā)和發(fā)射最大值分別為~405 nm和~450 nm。這些光譜特性使其成為太平洋藍™標記染料的jue佳替代品。mFluor™ Violet 450馬來酰亞胺穩(wěn)定，與硫醇基團具有良好的反應性和選擇性。mFluor™ Violet 450馬來酰亞胺提供了一種方便的工具，用于標記單克隆、多克隆抗體或其他蛋白質（>10 kDa），用于使用紫色激光激發(fā)的流式細胞術應用。

示例協議

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復凍融循環(huán)。

1. mFluor™ Violet 450 馬來酰亞胺儲備溶液（溶液 B）

將無水DMSO加入mFluor™ Violet 450馬來酰亞胺的小瓶中，制成10 mM儲備溶液。通過移液或渦旋充分混合。

注意 在開始偶聯之前準備染料儲備溶液（溶液B）。請及時使用。延長染料儲備溶液的儲存可能會降低染料活性。溶液B在避光和潮濕的情況下可以在冰箱中儲存長達4周。避免凍融循環(huán)。

2. 蛋白質儲備溶液（溶液A）

將 100 μL 反應緩沖液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標蛋白溶液（例如抗體、蛋白濃度>如果可能，為 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白標記儲備液。

注意蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為6.5±0.5。

注意 不純抗體或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白質穩(wěn)定的抗體不會很好地標記。

注意 如果蛋白質濃度低于 2 mg/mL，則偶聯效率會顯著降低。為了獲得最佳標記效率，建議最終蛋白質濃度范圍為 2-10 mg/mL。

可選：如果您的蛋白質不含游離半胱an酸，則必須用DTT或TCEP處理蛋白質以產生硫醇基團。DTT或TCEP用于將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用DTT，則必須在將染料馬來酰亞胺與蛋白質偶聯之前，通過透析或凝膠過濾去除游離DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例協議：

在蒸餾水中制備 1 M DTT（15.4 mg/100 μL）的新鮮溶液。

在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液加入 20 μL DTT 原液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱an酸對胱an酸的再氧化）。

將還原的IgG通過用“交換緩沖液"預平衡的過濾柱。從色譜柱上收集 0.25 mL 餾分。

確定蛋白質濃度并將餾分與大部分IgG合并。這可以通過分光光度法或比色法完成。

在此步驟之后盡快進行偶聯（參見示例實驗方案）。

注意 IgG 溶液應為 >4 mg/mL 以獲得最佳結果。如果抗體濃度低于 2 mg/mL，則應進行濃縮。在緩沖液交換柱上包括額外的10%的損失。

注意 還原可以在pH為7-7.5的幾乎任何緩沖液中進行，例如MES、磷酸鹽或TRIS緩沖液。

注意 步驟 3 和 4 可以用透析代替。

實驗方案樣本

該標記方案是為山羊抗小鼠IgG與mFluor™ Violet 450馬來酰亞胺的偶聯物開發(fā)的。您可能需要進一步優(yōu)化您的特定蛋白質。

注意每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比例的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。

運行偶聯反應

1. 使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質）的摩爾比為 10：1 作為起點：將 5 μL 染料儲備溶液（溶液 B，假設染料儲備溶液為 10 mM）加入蛋白質溶液（95 μL 溶液 A）的小瓶中，有效搖勻。假設蛋白質濃度為0mg / mL，蛋白質的分子量為~05KD，蛋白質的濃度為~10.200mM。

注意 我們建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10：1。如果太少或太高，請分別以 5：1、15：1 和 20：1 確定最佳染料/蛋白質比例。

2. 繼續(xù)在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化偶聯

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱純化的染料-蛋白質偶聯物的示例。

1. 根據制造說明制備Sephadex G-25色譜柱。

2. 將反應混合物（來自“運行共軛反應"）加載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。

3. 一旦樣品剛好在頂部樹脂表面下方運行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4. 向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。合并含有所需染料-蛋白質偶聯物的級分。

注意 為了立即使用，染料-蛋白偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分用于多次使用。

注意 對于長期儲存，染料-蛋白質偶聯物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

  AAT Bioquest  mFluor™ Violet 450 maleimide 

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